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May 04, 2024

Titania-Nanospikes aktivieren die Makrophagen-Phagozytose durch Liganden

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 12250 (2022) Diesen Artikel zitieren 1314 Zugriffe 3 Zitate 1 Altmetric Metrics Details Makrophagen-Phagozytose ist ein wichtiges Forschungsziel, das es zu bekämpfen gilt

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Die Makrophagenphagozytose ist ein wichtiges Forschungsziel zur Bekämpfung verschiedener entzündlicher oder Autoimmunerkrankungen; Allerdings wurde das Phänomen nie mit künstlichen Mitteln kontrolliert. Durch alkalische Ätzbehandlung erzeugte Titania-Nanospikes können die Makrophagenpolarisierung auf einen M1-ähnlichen Typ abstimmen und möglicherweise die Makrophagenphagozytose regulieren. Diese In-vitro-Studie zielte darauf ab, festzustellen, ob die durch alkalische Ätzbehandlung erzeugten zweidimensionalen Titandioxid-Nanooberflächen die Makrophagen-Phagozytose durch Nanospike-vermittelte Kontaktstimulation aktivierten. Auf zweidimensionalen reinen Titanplatten erzeugten alkalische Ätzbehandlungen mit verschiedenen Protokollen superhydrophile Nanooberflächen mit Hydroxylfunktionsgruppen und mäßigen oder dichten Nanospitzen. Beide Arten von Titandioxid-Nanooberflächen förderten die phagozytische Aktivität der Maus-Makrophagen-ähnlichen Zelllinie J774A.1 durch Hochregulierung von M1-Polarisationsmarkern und Phagozytose-bezogenen Rezeptoren, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren (TLR2 und 4). Im Gegensatz dazu aktivierten die hydrophoben glatten oder mikroaufgerauten Titanoberflächen weder die Makrophagen-Phagozytose noch die Expression verwandter Rezeptoren. Diese Phänomene blieben auch unter der Antikörperblockade des Makrophagen TLR2 unverändert, wurden jedoch für jede durch ultraviolette Strahlung angeregte Oberfläche entweder unterdrückt oder verstärkt. Titania-Nanospikes induzierten die Paxillin-Expression und lieferten physikalische Reize für Makrophagen, deren Ausmaß positiv mit den TLR-Expressionsniveaus korrelierte. Die Ligandenstimulation mit Lipopolysaccharid erhöhte nicht die Makrophagen-TLR-Expression, verstärkte jedoch die M1-Marker-Expression durch Titandioxid-Nanooberflächen weiter. Diese Ergebnisse zeigten, dass die zweidimensionalen Titandioxid-Nanooberflächen die Makrophagen-Phagozytose aktivierten, indem sie die Expression von Phagozytose-bezogenen Rezeptoren durch Nanospike-vermittelte Kontaktstimulation verstärkten und so die physikalischen Oberflächeneigenschaften auf ligandenunabhängige Weise unterstützten.

Phagozytose ist ein entscheidender Mechanismus der angeborenen Immunität, der Krankheitserreger von einer infizierten Stelle eliminiert. Phagozytose verlangsamt die Verbreitung von Krankheitserregern und reduziert nachfolgende Entzündungsreaktionen in lokalen Geweben1. Professionelle Phagozyten wie Neutrophile, Monozyten und von Monozyten abgeleitete oder im Gewebe ansässige Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Phagozytose2. Die Makrophagen-Phagozytose reinigt nicht nur Mikroben, sondern auch absterbende Neutrophile und bekämpft Krankheitserreger als erste Reaktion1. Dieses Phänomen ist an der Auslösung und Auflösung von Entzündungen in der frühen Phase beteiligt, deren Scheitern zu einer anhaltenden und schließlich chronischen Entzündung führt. Makrophagen können sich um Biomaterialien herum ansammeln und lokale Entzündungsreaktionen und Wundheilung steuern3. Darüber hinaus ist die Phagozytose von Makrophagen stark mit der Hemmung der Tumorinvasion verbunden und spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion der Antitumorimmunität durch die Überbrückung der angeborenen und adaptiven Immunität4. Daher hat die Technologie zur Abstimmung der Makrophagen-Phagozytose Aufmerksamkeit für die Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Instrumente für eine Vielzahl biologischer Ereignisse wie entzündliche und onkologische Erkrankungen oder Geweberegeneration erregt5,6.

Toll-like-Rezeptoren (TLR2 und 4) sind auf der Zelloberfläche lokalisiert und reagieren auf pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) zur mikrobiellen Erkennung7. TLR2 erkennt hauptsächlich Lipoproteine, Peptidoglycane, Lipoteichonsäure und Zymosan (Pilzglucane), während TLR4 Lipopolysaccharide (LPS) erkennt 8. Die TLR-Aktivierung in Makrophagen fördert die Phagozytose für die mikrobielle Clearance und Antigenpräsentation 9. TLR2 und 4 können auch Titanpartikel erkennen, die PAMPs enthalten10 , dessen längere Einwirkung zu einer durch Abnutzungsrückstände verursachten periimplantären Osteolyse führt11. Darüber hinaus sind Scavenger-Rezeptoren (SRs), wie Scavenger-Rezeptor-A (SR-A oder CD204) oder Makrophagen-Rezeptor mit kollagener Struktur (MARCO), an der Erkennung verschiedener Arten von Liganden beteiligt, zu denen auch biologisch-organische Komponenten gehören als unopsonisierte künstliche Partikel12,13. TLRs interagieren mit SRs und fördern die Phagozytose9. Die Kontrolle der Expression dieser Rezeptoren ist ein Schlüssel zur Aktivierung der Makrophagen-Phagozytose.

Die Funktionen von Immunzellen werden nicht nur durch biochemische Moleküle reguliert, sondern auch durch physikalische Stimulation aus der umgebenden Mikroumgebung14. Fokale Adhäsionsplaques erfassen die Mikroumgebung und regulieren die Polarisation und Funktion von Makrophagen über Mechanotransduktionssysteme, an denen fokale Adhäsionskinasen und Aktinkontraktion beteiligt sind15. Im Vergleich zur Ligandenstimulation durch biochemische Moleküle können durch physikalische Stimulation aktivierte Mechanotransduktionssysteme einen größeren Einfluss auf die Regulierung der Makrophagenfunktion haben16. Mechanotransduktionssysteme sind auch an TLR-Signalwegen in Makrophagen beteiligt17. Die Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien können die Zellen in Mikroumgebungen physikalisch dazu anregen, ihre Funktionen zu regulieren18. Zweidimensionale (2D) gemusterte Plattformen, die aus eindimensionalen (1D) vertikalen Nanostrukturen bestehen, haben in letzter Zeit aufgrund ihrer immunmodulatorischen Wirkung Aufmerksamkeit erregt19. Dimethylpolysiloxan-Mikropillen aktivieren beispielsweise zytotoxische T-Lymphozyten, was durch die erhöhte Expression von Interferon-gamma (IFN-γ)20 oder durch die erhöhte Abtötungsfähigkeit von Zielzellen21 gezeigt wird. Nanodrähte auf Zinkoxidbasis verstärkten die durch den Klasse-I-Histokompatibilitätskomplex induzierte Expression des Lysosomal-assoziierten Membranproteins-1 in natürlichen Killerzellen22. Diese Arten von 2D-gemusterten Plattformen mit vertikalen 1D-Nanostrukturen verformen die Zellwand oder Zellmembran und lösen verschiedene biologische Ereignisse innerhalb von Zellen oder Mikroorganismen aus23,24. Es wurden jedoch keine 2D-gemusterten Plattformen als künstliche Umgebung zur Regulierung der phagozytischen Aktivität professioneller Phagozyten verwendet.

Eine alkalische Ätzbehandlung mit konzentriertem Natriumhydroxid erzeugt zahlreiche und dichte Nanospitzen auf Titandioxid (TiO2)-Basis auf Titansubstraten25,26. Solche Titandioxid-Nanospikes können Makrophagen physisch stimulieren und sie so einstellen, dass sie Infektionen widerstehen. Nanogespikte Titania-Partikel fördern die Entzündungsreaktion der Makrophagen durch physikalische Aktivierung und fungieren in Verbindung mit TLR4-Agonisten als Adjuvans für die Immunmodulation5. Titania-Nanospikes, die durch alkalische Ätzbehandlung auf 2D-Titansubstraten erzeugt wurden, polarisieren Makrophagen in einen M1-ähnlichen Typ und stimmen sie so ab, dass sie Hemmfaktoren für die Differenzierung von Osteoklasten produzieren27. Sogar in anderen Zelltypen veränderten Titandioxid-Nanooberflächen mit Nanospikes die Zellmorphologie und steigerten ihre inhärenten Funktionen, ohne dass es zu unerwünschten Ereignissen kam25,26. Diese Beobachtungen legen nahe, dass durch alkalische Ätzbehandlung erzeugte Titandioxid-Nanooberflächen die phagozytischen Aktivitäten von Makrophagen über ein Mechanotransduktionssystem durch Nanospike-induzierte Kontaktstimulation regulieren. Diese In-vitro-Studie zielte darauf ab, festzustellen, ob die durch Alkaliätzbehandlung erzeugten 2D-Titanoxid-Nanooberflächen phagozytische Aktivitäten und die Expression verwandter Rezeptorexpressionen in Makrophagen durch Nanospike-vermittelte Kontaktstimulation regulieren.

Als Kultursubstrat wurden handelsübliche, 0,18 mm dicke Titanplatten der Güteklasse I (Nishimura Co., Ltd., Fukui, Japan) mit einer glatten (SM) Oberfläche verwendet. Sie wurden mit Aceton, Ethanol und Reinstwasser unter Ultraschall gereinigt. Ein SM-Titanblech mit einer säuregeätzten Oberfläche als repräsentative klinisch verwendete mikroaufgeraute (MR) Oberfläche wurde durch Eintauchen des Blechs in 67 % (w/w) Schwefelsäurelösung (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) hergestellt. Japan) bei 120 °C für 75 s25. Zwei Arten nanoaufgerauter (NR) Oberflächen wurden mithilfe einer alkalischen Ätzbehandlung hergestellt, wie zuvor beschrieben25,26,28. Kurz gesagt, SM-Titanbleche wurden 24 Stunden lang in Natriumhydroxid gekocht, mit hochreinem Wasser gewaschen, über Nacht an der Luft getrocknet, 1 Stunde lang in einem Ofen bei 600 °C bei stetig steigender Temperatur (5 °C/min) gesintert und schließlich luftgekühlt. Für die NR1-Oberfläche wurde eine 5 M Natriumhydroxidlösung bei 60 °C und für die NR2-Oberfläche eine 10 M Lösung bei 90 °C verwendet. Nach der alkalischen Ätzbehandlung bilden sich auf Titanblechen poröse und stachelige Titandioxid-Nanoschichten mit einer Dicke von mehreren hundert Nanometern27.

Um die Oberflächeneigenschaften zu bestimmen, die die Makrophagenreaktionen beeinflussen, wurden Titanproben mit hydrophiler Behandlung ohne Änderungen an der Oberflächentopographie als Kontrollen gemäß einer zuvor beschriebenen Methode hergestellt27. Um die oberflächliche Oxidschicht auf der Titan- oder Titanoxidoberfläche durch den photokatalytischen Effekt29 anzuregen, wurden die SM-, NR1- und NR2-Oberflächen drei Tage lang mit ultravioletten (UV) Strahlen unter Verwendung eines TFL-40 V UV-Transilluminators (UVP, Cambridge, England) bestrahlt. UK) mit einer Spitzenwellenlänge von 354 nm (UV-A-Bereich) im Hochintensitätsmodus. Mit Ausnahme der Proben, die einer UV-Behandlung unterzogen wurden, wurden alle anderen Proben unmittelbar vor der Verwendung autoklaviert. UV-bestrahlte Proben wurden unmittelbar nach der Behandlung einer Oberflächenanalyse oder Zellaussaat unterzogen.

Die Oberflächentopographie der Titanbleche wurde mit einem XL30-Rasterelektronenmikroskop (REM; Philips, Eindhoven, Niederlande) bewertet. Scheitelpunktextraktionsbilder der MR-, NR1- und NR2-Oberflächen wurden aus REM-Bildern mit 30.000-facher Vergrößerung erhalten, indem die hellen Flecken mit einem WinRoof-Bildanalysator (MITANI Corporation, Tokio, Japan) extrahiert wurden. Die Spitzendichte wurde durch Zählen der Scheitelpunkte pro Mikrometerfläche berechnet.

Die Höhen der Nanospikes wurden anhand vertikaler Rauheitsparameter bewertet: der arithmetischen mittleren Höhe (Sa) und der maximalen Peakhöhe (Sp). Diese Parameter wurden bei einer Länge von 120 μm auf jeder Oberfläche unter Verwendung eines Talysurf PGI 1250A-Lasermikroskops (Taylor Hobson, Ametek, Leicester, UK) mit Welligkeitsentfernung durch Annäherung an ein kubisches Polynom gemessen.

Die Oberflächenenergie jedes Titanblechs wurde durch Messung des Wasserkontaktwinkels von 30 μl destilliertem Wasser (DW) mit einer CA-X-Tropfmaschine (Kyowa Interface Science Co. Ltd., Saitama, Japan)27 bestimmt. Ein Wasserkontaktwinkel > 90° wurde als hydrophob definiert; < 90°, hydrophil; und < 10°, superhydrophil30.

Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) der Oberflächen wurden mit einem IRT7000-Linear-Array-Bildmikroskop (JASCO Corporation, Tokio, Japan) erhalten. Das Mikroreflexionsspektrum wurde im Bereich von 4000–2000 cm–1 mit einer spektralen Auflösung von 4 cm–1, 500 Akkumulationen und einer Apertur von 50 μm2 aufgezeichnet. Die Hintergrundkorrektur wurde basierend auf dem Oberflächenspektrum von SM durchgeführt.

Die Maus-Makrophagen-ähnlichen Zelllinien (JCRB9108, J774A.1), die von der Zellbank der japanischen Sammlung von Forschungsbioressourcen (National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition, Tokio, Japan) erhalten wurden, wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Nacalai) kultiviert Tesque, Kyoto, Japan), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Japan Bioserum, Hiroshima, Japan), 200 mmol/L L-Glutaminlösung (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), 100 U Penicillin und 100 μg/ml Streptomycinlösung (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) bei 37 °C in feuchtem 5 % CO227. Nach einer Konfluenz von 80 % wurden die Zellen durch Abschaben ohne Ablösungsreagenzien abgelöst. Sie wurden mit einer Dichte von 2,0 × 104 bis 3,0 × 105 Zellen/ml in Polystyrol-Kulturplatten mit 6, 12 oder 96 Vertiefungen mit oder ohne Titanfolien in DMEM mit den gleichen Zusätzen wie zuvor erwähnt ausgesät. Die Zellen wurden auch in DMEM ohne FBS kultiviert, um die Zellreaktionen auf jedem Substrat unter serumfreien Bedingungen zu bewerten. Die Zellen wurden 1 oder 3 Tage lang kultiviert.

Gemäß unseren vorherigen Protokollen27 wurde eine M1-Kontrolle von J774A.1-Zellen unter Verwendung von 100 ng/ml LPS aus Escherichia coli O55:B5, gereinigt durch Phenolextraktion (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), und 10 ng induziert /ml rekombinantes Maus-IFN-γ (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) für 24 Stunden, während eine M2-Kontrolle unter Verwendung von 20 ng/ml rekombinantem Maus-IL-4 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) für 24 Stunden induziert wurde.

Um die zeitlichen Auswirkungen der TLR4-Ligandenstimulation auf die TLR2- und TLR4-Expression in Makrophagen zu analysieren, wurden J774A.1-Zellen mit einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen/ml auf einer Polystyrol-Kulturplatte mit 6 Vertiefungen ausgesät und in DMEM mit oder ohne inkubiert die M1-induzierenden Reagenzien für 3, 6, 12 und 24 Stunden, wie zuvor beschrieben.

Um die Beteiligung der TLR2-Ligandenstimulation an der Aktivierung von Makrophagen durch Titan- oder Titanoxidoberflächen zu analysieren, wurden J774A.1-Zellen in einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen/ml auf einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen mit oder ohne Titanfolien ausgesät und inkubiert in DMEM mit oder ohne 10 µg/ml rekombinantem Anti-TLR2-Antikörper (Kat. Nr. 153.002, Biolegend, San Diego, CA, USA) für 1 Stunde. Nach einer Stunde Inkubation wurde die Kultur 24 Stunden lang in frischem DMEM mit oder ohne M1-induzierenden Reagenzien weiter inkubiert. Die Gültigkeit der Anti-TLR2-Antikörperkonzentration und der Kokulturzeit wurde in einer unabhängigen J774A.1-Kultur unter Verwendung des TLR2-Liganden Zymosan (Kat.-Nr.: NBP2-26,233, Novus Biological, Oxford Abingdon, UK) bewertet. Zur Validierung der Blockierungsbedingungen mit dem Anti-TLR2-Antikörper wurden die geeignete Konzentration von Zymosan und die Kokulturzeit bestimmt. J774A.1-Zellen wurden in einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen/ml auf einer Polystyrol-Kulturplatte mit 6 Vertiefungen ausgesät und in DMEM mit 0, 1, 5, 10 und 20 µg/ml Zymosan für 12 und 24 Stunden inkubiert.

Um die synergistischen Effekte der Ligandenstimulation und Titan- oder Titanoxidoberflächen auf Makrophagen zu analysieren, wurden J774A.1-Zellen mit einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen/ml auf einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen mit oder ohne Titanfolien ausgesät und in DMEM mit oder inkubiert ohne LPS für 24 h. Die für die Ligandenstimulation erforderliche LPS-Konzentration wurde in einer unabhängigen J774A.1-Kultur in einer Polystyrol-Kulturplatte mit 6 Vertiefungen unter Verwendung von 0, 100, 500 und 1.000 ng/ml bestimmt.

Die Gesamt-RNA aus der J774A.1-Zellkultur wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Ambion/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) extrahiert. Die RNA-Isolierung und -Reinigung wurde mit einem RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt, gefolgt von einer DNase-Behandlung (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Komplementäre DNA (cDNA) wurde mit einem PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Shiga, Japan)27 synthetisiert. Die Expression der Messenger-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung eines Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan) für SYBR Green-basierte RT-PCR auf einem StepOnePlus Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Zielgenexpressionsniveaus wurden mithilfe der Vergleichszykluszeitmethode (ΔΔCT) quantitativ analysiert. Als Housekeeping-Gen wurde Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet. Die 2ΔΔCT-Methode wurde verwendet, um die fachen Veränderungen der Genexpression in jeder experimentellen Probe im Vergleich zu unbehandeltem Polystyrol zu berechnen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Am ersten Tag wurden auf Polystyrol-, Titan- oder Titanoxidoberflächen kultivierte J774A.1-Zellen mit 10 % neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden unspezifische Bindungsproteine ​​unter Verwendung von Blockierungspuffer, der 3,0 % BSA, 0,1 % Tween 20 und 0,1 % Triton-X enthielt, 60 Minuten lang blockiert. Die Zellen wurden mit polyklonalem Primärantikörper gegen induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) vom Kaninchen (ab3523, Abcam, Cambridge, UK) und monoklonalem Maus-Anti-TLR4 (SC-293072, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) inkubiert ) oder monoklonale Kaninchen-Anti-Paxillin-Primärantikörper (ab32084) in einer Verdünnung von 1/200, 1/100 bzw. 1/250. Die Zellen wurden im Dunkeln bei 4 °C über Nacht inkubiert, mit PBS gewaschen und erneut 1,5 Stunden im Dunkeln in einer Mischlösung bestehend aus 1/200 verdünntem Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus (A11001, Thermo Fisher Scientific) inkubiert ) oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (ab150081, Abcam), 1/400 verdünntes Rhodamin-Phalloidin für die F-Actin-Färbung und 1/500 verdünntes Hoechst 33.258 für die Kernfärbung. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 90 % Glycerin fixiert und unter einem konfokalen Lasermikroskop LSM 780 beobachtet.

Um die Zytotoxizität jeder vorbereiteten Oberfläche zu bewerten, wurde die Anzahl der anhaftenden Zellen unter Verwendung des Tetrazoliumsalz-Reagens WST-1 (Cell Proliferation Reagent WST-1, Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Deutschland) quantifiziert. das durch Reaktion mit Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, das in lebensfähigen Zellen vorkommt, farbige Formazanprodukte bildet. 24 Stunden lang gezüchtete Zellen wurden mit einem frischen Kulturmedium, das das WST-1-Reagenz enthielt, 4 Stunden lang bei 37 °C in einer 5 %igen CO2-Atmosphäre inkubiert und die Absorption bei 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät abgelesen.

Um die auf jeder Oberfläche vorhandenen Endotoxine zu quantifizieren, wurden Titanproben ohne Zellen in ein Limulus-Amöbozyten-Lysat-Reagenz (Limulus Color KY Test Wako, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) getaucht, das rekombinanten Faktor C und einen Inhibitor des β-d-Glucan-sensitiven Faktors enthielt G. Diese Analyse basiert auf den aufeinanderfolgenden Reaktionen, bei denen Endotoxine den Serinprotease-Vorläufer und das Gerinnungsenzym aktivieren, schließlich das gelbe Farbentwicklungssubstrat (Boc-Thr-Gly-Arg-pNA) hydrolysieren und eine Farbentwicklungsgruppe freisetzen (pNA). Die Proben wurden 15 Minuten lang mit dem Reagenz umgesetzt und die Absorption wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät abgelesen. Die Endotoxinkonzentration auf jeder Oberfläche wurde anhand einer Kalibrierungskurve unter Verwendung einer Endotoxin-Standardlösung bestimmt.

Die phagozytische Aktivität von Makrophagen auf Polystyrol- und Titan- oder Titanoxidoberflächen wurde unter Verwendung fluoreszierend markierter Mikrokügelchen mit 1 μm Durchmesser (Fluoresbrite YG Microspheres 1.0, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA) bewertet (Anregungsmaximum: 441 nm, Emissionsmaximum: 486 nm). . J774A.1-Zellen, die einen Tag lang auf Polystyrol- und Titan- oder Titanoxidoberflächen kultiviert wurden, wurden mit Mikrokügelchen, die dem Kulturmedium in einer Dichte von 20 Partikeln/Zelle zugesetzt wurden, für weitere 4 Stunden co-inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit 10 % neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit Rhodamin-Phalloidin angefärbt, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Ein Deckglas wurde auf die Kultur auf Polystyrol- und Titan- oder Titanoxidoberflächen mit einem Eindeckmedium gelegt, das 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; VECTASHIELD H-1200, Vector Laboratories, Inc.) enthielt. Die Kulturen wurden unter einem BZ-X810-Fluoreszenzmikroskop (Keyence Corporation, Osaka, Japan) beobachtet. Grüne, hellblaue oder blaue Punktsignale, die in den zusammengeführten Bildern mit dem Zellkörper überlappten, wurden als phagozytierte Mikrokügelchen definiert. Die Anzahl der Mikrokügelchen pro Elementarzelle wurde mit einem WinRoof-Bildanalysator gemessen.

Am ersten Tag wurden auf Titan- oder Titanoxidoberflächen kultivierte J774A.1-Zellen 30 Minuten lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben wurden mit DW gewaschen, an der Luft getrocknet und dann mit einer Gold/Palladium-Legierung sputterbeschichtet. An den Zellen wurden REM-Analysen mit einem XL30-System (Philips, Eindhoven, Niederlande) bei einer Beschleunigungsspannung von 10 keV durchgeführt. Lineare oder punktförmige Teile mit der gleichen hohen Helligkeit wie die Spitzen der Titan- oder Titanoxidoberflächen in REM-Bildern mit 10.000-facher Vergrößerung des peripheren Bereichs des Zellkörpers wurden mit der gleichen Methode wie oben erfasst. Die leuchtenden Flecken wurden als die Stellen definiert, an denen sich die Spitzen von Titan- oder Titanoxidspitzen in den Zellkörper gruben, bis die Scheitelformen sichtbar wurden. Das Flächenverhältnis der leuchtenden Punkte zum Gesichtsfeld wurde mit einem Bildanalysator gemessen.

Zur Oberflächenanalyse von Titanblechen wurden drei unabhängige Proben auf jeder Titan- oder Titanoxidoberfläche einer Reihe von Messungen unterzogen. Sechs unabhängige Proben wurden dem Endotoxintest unterzogen. Alle Kulturexperimente mit Ausnahme von Phagozytose- und Immunfluoreszenztests wurden an mindestens drei unabhängigen Zellchargen (N = 3 oder 4) durchgeführt. Genexpressionsanalysen wurden dreimal durchgeführt und repräsentative Datensätze wurden nach Bestätigung der Konsistenz präsentiert (N = 3). Immunfluoreszenztests für die TLR4- und Paxillin-Expression wurden an 12–14 Zellen (N = 12–14) bzw. 15–52 Zellen (N = 15–52) an mehreren zufällig ausgewählten Stellen aus einer einzelnen Zellkultur durchgeführt. Die Anzahl der Kügelchen pro Elementarzelle wurde auch an mehreren Stellen gemessen, die zufällig aus einer einzelnen Zellkultur ausgewählt wurden, wobei Zellen (N = 68–358) unabhängig von der Kügelchenaufnahme verwendet wurden. Tests mit einer einzelnen Zellkultur wurden an verschiedenen Tagen wiederholt, um die Konsistenz der Ergebnisse zu bestätigen. Eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um Unterschiede zwischen mehreren Versuchsgruppen zu bewerten, während eine zweiseitige ANOVA verwendet wurde, um die Wechselwirkungen zwischen Unterschieden in den Substrattypen und Kultivierungsperioden, verwendeten Reagenzien oder Benetzbarkeitsanpassungen zu bewerten. Gegebenenfalls wurden der Post-hoc-Tukey-Test auf ehrlich signifikante Differenz (HSD), der Mehrfachvergleichstest von Bonferroni, der Games-Howell-Test oder der Dunnett-Test verwendet. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt. Alle statistischen Analysen wurden mit IBM SPSS Statistics Version 21 (IBM Japan, Ltd., Tokio, Japan)27 durchgeführt.

Die REM-Bilder zeigten ein relativ flaches Erscheinungsbild mit flachen Mikrorillen und bergkettenartigen Unregelmäßigkeiten mit relativ scharfen Graten (Abb. 1A, Pfeilspitzen) auf den SM- bzw. MR-Titanoberflächen. Im Gegensatz dazu wiesen die Titanoxidoberflächen NR1 und NR2 mehrere Nanospitzen und ein schwammartiges inneres Netzwerk auf der oberflächlichen und darunter liegenden Schicht auf. Die Nanospikes (Abb. 1A, Doppelpfeile) auf den NR2-Titandioxid-Oberflächen waren dichter als die auf den NR1-Oberflächen (Abb. 1A, Pfeile). Die Spitzendichte pro Mikrometerfläche betrug auf den MR-Titanoberflächen weniger als 4, während der Wert für die NR1- und NR2-Titanoxidoberflächen etwa 10 bzw. 15 betrug (Abb. 1A, Histogramm; P < 0,05, Tukey-HSD-Test). Die Rauheitsparameter, die die Höhe der Spitzen anzeigen, wie Sa und Sp, waren auf den MR-Titanoberflächen mit einer Rauheit im Mikrometerbereich am höchsten (Abb. 1B; P < 0,05, HSD-Test nach Tukey). Die Höhen der Spitzen auf den Titanoxidoberflächen NR1 und NR2 lagen im Nanobereich. Die NR1-Titanoxidoberflächen wiesen in diesen Rauheitsparametern etwas höhere Rauheitsparameter auf als die SM-Oberflächen, wohingegen die NR2-Titanoxidoberflächen das Doppelte oder mehr Rauheit aufwiesen als die SM- und NR1-Oberflächen (Abb. 1B; P < 0,05, Tukey-HSD-Test).

Topografische und physikalisch-chemische Merkmale von Titandioxid-Nanooberflächen (A) Repräsentative Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) von Titanblechen mit glatten (SM), mikroaufgerauten (MR) und nanoaufgerauten (NR) 1- und 2-Oberflächen. Das Histogramm zeigt die Spitzendichte an, die durch Zählen der Scheitelpunkte pro Mikrometerfläche auf der MR-, NR1- und NR2-Oberfläche ermittelt wird. (B) Repräsentative Vogelperspektiven (obere Felder) und vertikale Rauheitsparameter (untere Histogramme) wie Sa und Sp, bestimmt durch ein Lasermikroskop, (C) Wasserkontaktwinkel, bestimmt durch eine sessile Tropfenmethode und (D) FTIR Spektren jeder Art von Oberflächen. Gelbe Pfeilspitzen, Pfeile und Doppelpfeile in (A) SEM-Bildern mit hoher Vergrößerung weisen auf scharfe Grate auf der MR-Titanoberfläche und mehrere Nanospitzen auf den Titanoxidoberflächen NR1 bzw. NR2 hin. Schwarze Pfeile in (D) FTIR-Spektren zeigen den Peak der Hydroxylgruppen (-OH) an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest [HSD]). Sa, arithmetische mittlere Höhe; Sp, maximale Grubenhöhe; FTIR, Fourier-Transformations-Infrarot. Beachten Sie, dass die NR1- und NR2-Oberflächen dichte Nanospikes (A und B), Superhydrophilie (C) und das Vorhandensein von Hydroxylgruppen aufwiesen, was mit einem früheren Bericht übereinstimmt 27.

NR1 und NR2 zeigten Superhydrophilie, was durch Wasserkontaktwinkel < 10° (Abb. 1C; P < 0,05, Tukey-HSD-Test) und das Vorhandensein der Hydroxylgruppe, einer typischen hydrophilen funktionellen Gruppe (in ihren FTIR-Spektren; Abb . 1D). Im Gegensatz dazu zeigten die SM- und MR-Titanoberflächen Wasserkontaktwinkel von etwa 100° (hydrophob) bzw. 70° (hydrophil) (Abb. 1C), ohne dass eine Hydroxylgruppe vorhanden war (Abb. 1D). Diese Ergebnisse stimmten mit den Beobachtungen einer früheren Studie überein, in der dieselben Analysen an denselben Arten von Titanproben durchgeführt wurden27.

Obwohl die Expression des repräsentativen M1-Genmarkers iNOS nicht den Werten in J774A.1-Zellen mit M1-Induktion entsprach, war sie in den unbehandelten Zellen an NR1 oder NR2 oder beiden an den Tagen 1 und 3 im Vergleich zu den unbehandelten Zellen hochreguliert auf Polystyrol und den anderen Titanoberflächen (Abb. 2A; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Die Expression eines anderen M1-Markergens, TNF-α, war auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen ebenfalls höher als auf den anderen Substraten, und zwar über drei Kultivierungstage hinweg (Abb. 2A; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Insbesondere war die TNF-α-Expression in den unbehandelten Zellen auf der NR2-Titandioxid-Nanooberfläche am Tag 1 höher als in den M1-induzierten Zellen (Abb. 2A; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Im Gegensatz dazu war die Expression der repräsentativen M2-Genmarker Arg1 und CD206 in J774A.1-Zellen auf keinem Substrat an den Tagen 1 und 3 im Vergleich zu den M2-induzierten Zellen merklich hochreguliert (Abb. 2B). Immunfluoreszenzsignale für iNOS wurden in M1-induzierten Zellen und unbehandelten Zellen, die am Tag 1 auf den NR1- oder NR2-Oberflächen kultiviert wurden, nachgewiesen (Abb. 2C). Diese Zellen wiesen kreisförmige Formen auf. Im Gegensatz dazu wurden in den M2-induzierten Zellen mit länglicher und spindelartiger Form und in unbehandelten Zellen mit polygonaler oder eichelartiger Form, die auf Polystyrol-, SM- oder MR-Oberflächen kultiviert wurden, keine iNOS-Signale nachgewiesen.

Auswirkungen von Titandioxid-Nanooberflächen auf die Expression von Polarisationsmarkern von Makrophagen Genexpression von M1-Polarisationsmarkern (A) induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und (B) M2-Polarisationsmarkern Arginase 1 ( Arg1) und Differenzierungscluster 206 (CD206) relativ zu Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurden durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in J774A.1-Zellen analysiert, die für die Tage 1 und 3 auf einer Polystyrol-Kulturplatte kultiviert wurden oder glatt (SM), mikroaufgeraut (MR) oder nanoaufgeraut (NR) 1 oder 2 Oberflächen mit oder ohne M1-Induktion. (C) Repräsentative konfokale Lasermikroskopiebilder der F-Actin- (rot), Kern- (blau) und iNOS-Färbung (grün) in den Zellen. (D) WST-1-basierte Bewertung der Anzahl adhärenter Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen am Tag 1. (E) Konzentrationen von Endotoxinen, die auf den Titan- oder Titanoxidoberflächen ohne Zellen nachgewiesen wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3 in A, B und C) oder Boxplots (N = 6 in E). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen ihnen hin (P < 0,05; Bonferronis Mehrfachvergleichstest oder Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest [HSD]). UT, unbehandelte Zellen; M1, M1-induzierte Zellen; M2, M2-induzierte Zellen; ns, nicht signifikanter Unterschied.

Die Anzahl der anhaftenden Zellen am ersten Tag unterschied sich nicht zwischen den Titan- und Titanoxidoberflächen (Abb. 2D; P > 0,05, Tukey-HSD-Test). Die Konzentration der auf der NR1-Oberfläche nachgewiesenen Endotoxine war höher als auf den anderen Oberflächen (Abb. 2E; P < 0,05, Tukey-HSD-Test), lag jedoch unabhängig von den Oberflächentypen unter 0,03 EU/ml.

Die M1-Induktion mit LPS und IFN-γ erhöhte die TLR4-Expression in J774A.1-Zellen auf einer Polystyrol-Kulturplatte erst 24 Stunden nach der Aussaat (Abb. 3A); Allerdings erhöhte die Induktion die TLR2-Expression 3 und 6 Stunden nach der Aussaat (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni) und nahm nach 12 Stunden ab (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Im Gegensatz dazu steigerten beide Titandioxid-Nanooberflächen die TLR4-Genexpression in unbehandelten J774A.1-Zellen am Tag 3 signifikant (Abb. 3B; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Darüber hinaus erhöhte sich die TLR2-Genexpression auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen am ersten Tag (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni) und das Expressionsniveau blieb am dritten Tag entweder erhalten oder erhöhte sich (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Die Expression dieser Gene nahm auf anderen Substraten unabhängig von der Ligandenstimulation nicht zu.

Auswirkungen von Titandioxid-Nanooberflächen auf die TLR-Expression von Makrophagen Genexpressionsniveaus von Toll-like-Rezeptor 2 (TLR2) und Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) im Verhältnis zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), analysiert durch Reverse-Transkription-Polymerase-Kette Reaktion (RT-PCR), in J774A.1-Zellen, kultiviert auf einer Polystyrol-Kulturplatte für 3, 6, 12 und 24 Stunden mit oder ohne M1-Induktion (A) oder auf Polystyrol oder glattem (SM), mikrogerautem ( MR) oder nanoaufgeraute (NR) 1- oder NR2-Oberflächen mit oder ohne M1-Induktion für die Tage 1 und 3 (B). (C) Repräsentative konfokale lasermikroskopische Bilder von F-Actin- (rot), Kern- (blau) und TLR4-Färbung (grün) sowie der Intensität von TLR4-markierten Signalen in den Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen. (D) Genexpressionsniveaus von TLR4 und TLR2 im Verhältnis zu GAPDH in den Zellen unter serumfreien Bedingungen. Weiße Pfeile zeigen TLR4-Fluoreszenzsignale an. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3 in A, B und D) und Boxplots (N = 12–14 in C). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, Bonferroni-Mehrfachvergleichstest in A und B oder Games-Howell-Test in C). UT, unbehandelte Zellen; M1, M1-induzierte Zellen; M2, M2-induzierte Zellen; CTCF, korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Beachten Sie (C) die starken TLR4-Signale in Makrophagen auf den Titanoxidoberflächen NR1 oder NR2 (Doppelpfeile), im Gegensatz zu schwächeren Signalen auf den anderen Oberflächen (Pfeile).

Im Vergleich zu den schwachen Immunfluoreszenzsignalen für TLR4-Proteine ​​in Zellen auf einer Polystyrol-Kulturplatte und der SM-Titanoberfläche (Abb. 3C, Pfeile) emittierten die unbehandelten Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen unter einem konfokalen Lasermikroskop starke und umfangreiche Signale für TLR4-Proteine ​​( Abb. 3C, Doppelpfeile). Die Intensität der TLR4-markierten Signale auf unbehandelten Zellen war auf der NR2-Titanoxidoberfläche am höchsten, gefolgt von der NR1-Titanoxidoberfläche (Abb. 3C, Boxplots; P < 0,05, Games-Howell-Test).

Die M1- oder M2-induzierten Zellen zeigten zusätzlich zu den unbehandelten Zellen auf den SM- oder MR-Titanoberflächen einen leichten oder keinen Anstieg der TLR4- und TLR2-Expressionsniveaus in serumfreiem Medium an den Tagen 1 und 3 (Abb. 3D). . Im Gegensatz dazu steigerten beide Titandioxid-Nanooberflächen die Expression dieser Gene an den Tagen 1 und 3 deutlich, selbst im serumfreien Medium (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni).

Unter dem konfokalen Lasermikroskop zeigten J774A.1-Zellen, die 4 Stunden lang mit fluoreszierenden Mikrokügelchen koinkubiert wurden, dass Mikrokügelchen auf den Zellkörpern sowohl auf den Titandioxid-Nanooberflächen stärker überlappten als auf den Polystyrol- und SM-Titanoberflächen (Abb. 4A). Die Anzahl der Mikrokügelchen pro Elementarzelle war auf der NR1-Titanoxidoberfläche am höchsten, gefolgt von der NR2-Titanoxidoberfläche (Abb. 4A, Punktdiagramme; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Die Expression von MARCO und SR-4 zur Erkennung biologischer und künstlicher Fremdstoffe in J774A.1-Zellen war bei Ligandenstimulation unterschiedlich. Die M1-Induktion regulierte die Expression von MARCO hoch, nicht jedoch die von SR-A (Abb. S1). Die Expression dieser Gene in den unbehandelten Zellen war auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen höher als auf der SM-Titanoberfläche (Abb. 4B; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Allerdings stieg die Expression mit der Exposition gegenüber Mikrokügelchen nicht weiter an (P > 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni), mit Ausnahme der Zellen auf der NR1-Titanoxidoberfläche (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni).

Auswirkungen von Titandioxid-Nanooberflächen auf die phagozytische Aktivität von Makrophagen (A) Repräsentative konfokale lasermikroskopische Bilder für F-Aktin- (rot), Kernfärbung (blau) und fluoreszierende Mikrokügelchen (hellblau); und Punktdiagramme für die Anzahl der Kügelchen pro Elementarzelle in Tag 1 J774A.1-Zellen, die 4 Stunden lang mit Mikrokügelchen auf einer Kulturplatte aus Polystyrol oder glatt (SM), mikrogerauht (MR), nanogerauht (NR) co-inkubiert wurden. 1 oder 2 Flächen. (B) Genexpression von Makrophagenrezeptoren mit kollagener Struktur (MARCO) und Klasse-A-Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren (SR-A) im Verhältnis zu Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), analysiert durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in die Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 68–358 in A und N = 3 in B). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Bonferroni-Mehrfachvergleichstest). Beachten Sie, dass (A) die Mikrokügelchensignale in Makrophagen auf den Titanoxidoberflächen NR1 oder NR2 stärker waren (Doppelpfeile), im Gegensatz zu schwächeren Signalen auf anderen Oberflächen (Pfeile).

Zymosan, ein TLR2-Ligand, regulierte die TNF-α- und IL-1β-Expression in konzentrationsabhängiger Weise bis zu 20 µg/ml in auf Polystyrol kultivierten J774A.1-Zellen sowohl nach 12 als auch nach 24 Stunden Inkubationszeit (Abb. S2A; P < 0,05). , Bonferronis Mehrfachvergleichstest). Eine einstündige Vorinkubation mit einem 10 μg/ml Anti-TLR2-Antikörper reduzierte die TNF-α-, IL-1β- und TLR2-Genexpression in J774A.1-Zellen, die 12 Stunden lang auf Polystyrol in frischem Medium kultiviert wurden (Abb. S2B; P < 0,05, Bonferronis Mehrfachvergleichstest). Die Expression dieser Gene verringerte sich weiter (P < 0,05, Tukey-HSD-Test) oder blieb unverändert (P > 0,05, Tukey-HSD-Test), selbst nach 12-stündiger Koinkubation mit 20 µg/ml Zymosan. Allerdings wurde die TLR4-Expression bei Vorinkubation mit TLR2-Antikörper hochreguliert und durch anschließende Co-Inkubation mit Zymosan weiter erhöht (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni).

Die Expression von iNOS und TNF-α in den M1-induzierten Zellen auf Polystyrol oder den unbehandelten J774A.1-Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen blieb hochreguliert, selbst wenn die Zellen 1 Stunde lang mit einem 10 μg/ml Anti-TLR2-Antikörper vorinkubiert wurden (Abb. 5A; P > 0,05, Tukey-HSD-Test). Im Gegensatz dazu wurde die Expression dieser Gene in M2-induzierten Zellen oder in unbehandelten Zellen auf Polystyrol oder auf SM- oder MR-Titanoberflächen nicht hochreguliert, unabhängig von der Vorinkubation mit Anti-TLR2-Antikörper (P > 0,05, Tukeys HSD-Test). Allerdings war die TLR2- und TLR4-Genexpression in den Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen unabhängig von der Vorinkubation mit dem Anti-TLR2-Antikörper hochreguliert (Abb. 5B; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Umgekehrt beeinflusste die Vorinkubation mit Anti-TLR2-Antikörper die Expression dieser Gene kaum, unabhängig vom Substrattyp oder der M1-Induktion (P < 0,05, Bonferronis Mehrfachvergleichstest).

Für die Makrophagenaktivierung durch Titandioxid-Nanooberflächen ist keine TLR-Stimulation erforderlich. Genexpressionen von (A) induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), (B) Toll-like-Rezeptor (TLR) 4 und TLR2 relativ gegen Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), wie durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in J774A.1-Zellen analysiert, die mit oder ohne 10 μg/ml Anti-TLR2-Antikörper 1 Stunde lang vorinkubiert und dann auf einem Polystyrol kultiviert wurden Kulturplatte oder auf glatten (SM), mikroaufgerauten (MR) oder nanoaufgerauten (NR) 1 oder 2 Oberflächen in frischem DMEM mit oder ohne M1-Induktion für 24 Stunden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest [HSD] in A, Bonferroni-Mehrfachvergleichstest in B).

Um die LPS-Konzentration für die Ligandenstimulation zu bestimmen, wurden J774A.1-Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen LPS-Konzentrationen auf einer Polystyrol-Kulturplatte koinkubiert (Abb. 6A). Die Zugabe von LPS ≥ 500 ng/ml reduzierte die Menge an anhaftenden Zellen und erhöhte die IL-1β-Expression (P < 0,05, Dunnett-Test) in den J774A.1-Kulturen in konzentrationsabhängiger Weise. Daher wurde 100 ng/ml LPS als geeignete Konzentration für die Ligandenstimulation von J774A.1-Zellen auf Titan- oder Titanoxidoberflächen ausgewählt. Die Expression von TNF-α und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) in J774A.1-Zellen auf Polystyrol-Kulturplatten und auf SM- und MR-Titanoberflächen wurde durch LPS-Zugabe hochreguliert (Abb. 6B; P < 0,05, Bonferronis Vielfaches). Vergleichstest). Beide Titandioxid-Nanooberflächen regulierten die Expression dieser Gene ohne LPS-Zusatz (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni) auf Niveaus, die mit denen in anderen Kulturen mit LPS-Zusatz vergleichbar oder höher waren. Darüber hinaus wurde die Hochregulierung dieser Gene durch beide Titandioxid-Nanooberflächen durch die Zugabe von LPS weiter deutlich verstärkt (P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Im Gegensatz dazu veränderte die Zugabe von LPS die Hochregulierung der TLR4-Expression durch Titandioxid-Nanooberflächen nur geringfügig (Abb. 6C; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni) oder veränderte die Expression auf den anderen Substraten (P > 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni).

Zusätzliche Effekte der Ligandenstimulation auf die Makrophagenaktivierung durch Titandioxid-Nanooberflächen (A) Repräsentative mikroskopische Bilder von J774A.1-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen an Lipopolysaccharid (LPS; 100, 500 und 1000 ng/ml) auf einer Polystyrol-Kulturplatte koinkubiert wurden 24 Std. Ein Histogramm zeigt die Genexpression von Interleukin-1 Beta (IL-1β) im Verhältnis zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), analysiert durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), in verschiedenen LPS-Konzentrationen. Genexpression von (B) Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und (C) Expression der Toll-like-Rezeptor-4-Gene (TLR4) im Vergleich zu GAPDH, wie analysiert durch RT-PCR, in J774A.1-Zellen, die mit oder ohne 100 ng/ml LPS auf Polystyrol oder glatten (SM), mikrogerauten (MR) oder nanogerauhten (NR) 1 oder 2 Oberflächen kokultiviert wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Dunnett-Test in A und Bonferroni-Mehrfachvergleichstest in B und C).

Am ersten Tag wurde in den unbehandelten J774A.1-Zellen auf einer Polystyrol-Kulturplatte und den SM- und MR-Titanoberflächen ein leichter Anstieg der Expression eines fokalen Adhäsions-assoziierten Adapterproteins, Paxillin, beobachtet (Abb. 7A, Pfeile). Im Gegensatz dazu wurde Paxillin in unbehandelten Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen stark exprimiert (Abb. 7A, Doppelpfeile). Die Intensität der Paxillin-markierten Signale war in Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen, insbesondere auf der NR2-Titandioxid-Oberfläche, höher als auf den anderen Oberflächen (Abb. 7B; P < 0,05, Tukey-HSD-Test). Die Expression des Paxillin-Gens (Pxn) in den unbehandelten J774A.1-Zellen war an den Tagen 1 und 3 auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen deutlich stärker hochreguliert als die Werte in den Zellen auf den anderen Substraten (Abb. 7C; P < 0,05, Mehrfachvergleich von Bonferroni). prüfen).

Auswirkungen von Titandioxid-Nanooberflächen auf das Adhäsionsverhalten von Makrophagen Repräsentative konfokale lasermikroskopische Bilder von (A) F-Actin- (rot), Kern- (blau) und Paxillin- (grün) Färbungen und (B) der Intensität von Paxillin-markierten Signalen in J774A. 1 Zellen, kultiviert auf einer Polystyrol-Kulturplatte oder glatten (SM), mikroaufgerauten (MR) oder nanoaufgerauten (NR) 1 oder 2 Oberflächen am Tag 1. (C) Genexpression von Paxillin (Pxn) relativ zu Glycerinaldehyd 3 -Phosphatdehydrogenase (GAPDH), analysiert durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), in den Zellen unter den entsprechenden Kulturbedingungen an den Tagen 1 oder 3. (D) Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Bilder und der Bereich Verhältnis der leuchtenden Flecken pro Flächeneinheit innerhalb des peripheren Bereichs des Zellkörpers in den am Tag 1 auf jeder Oberfläche kultivierten Zellen. (E) Streudiagramme, die eine positive lineare Beziehung zwischen dem Flächenverhältnis der leuchtenden Flecken pro Flächeneinheit oder der Intensität von anzeigen Paxillin-markierte Signale und die Spike-Dichte oder (F) die Genexpressionsniveaus von Toll-like-Rezeptor (TLR) 4 und TLR2 im Vergleich zu GAPDH, analysiert durch RT-PCR, in Makrophagen auf den MR-, NR1- und NR2-Oberflächen. Daten dargestellt als Boxplots (N = 15–52 in B) oder Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3 in C und N = 5–8 in D). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest [HSD] in B, Bonferroni-Mehrfachvergleichstest in C und Games-Howell-Test in D). CTCF, korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Beachten Sie (A) die starken Paxillinsignale in Makrophagen auf den NR1- oder NR2-Titanoxidoberflächen (Doppelpfeile) im Gegensatz zu weniger Signalen auf den anderen Oberflächen (Pfeile) und (D) die leuchtenden Flecken (gelbe Pfeile), die den Eckpunkten von entsprechen Oberflächenspitzen, die sich in die peripheren Teile des Makrophagen-Zellkörpers graben (gelbes gestricheltes Rechteck innerhalb des weißen gestrichelten Kreises), sind auf den NR1- und NR2-Titanoxidoberflächen im Vergleich zu denen auf der MR-Titanoberfläche erhöht.

SEM-Beobachtungen der Tag-1-Kultur zeigten, dass die MR-, NR1- und NR2-Oberflächen leuchtende Flecken an der Peripherie der Zelloberfläche bildeten, indem sie den Zellkörper mit den Spitzen der Stacheln aufspießten (Abb. 7D, Pfeile). Insbesondere zeigten beide Titanoxid-Nanooberflächen sieben oder mehr Glanzpunkte als die MR-Titanoberfläche (Abb. 7D, Histogramm; P < 0,05, Games-Howell-Test), wobei die Titanoxidoberfläche NR2 einen etwas höheren Glanzwert aufwies als die NR1 Titanoxidoberfläche (P < 0,05, Games-Howell-Test). Für alle aufgerauten Oberflächen zeigten der Mittelwert des Flächenverhältnisses der leuchtenden Flecken pro Flächeneinheit (Abb. 7D) und der Medianwert der Paxillin-Expression (Abb. 7B) eine positive lineare Beziehung (Abb. 7E) mit den Mittelwerten von die Spitzendichte (Abb. 1A). Diese Werte zeigten auch eine positive lineare Beziehung (Abb. 7F) mit den Mittelwerten der Expressionsniveaus von TLR2 und TLR4 in Zellen auf jeder aufgerauten Oberfläche (Abb. 3B).

UV-Bestrahlung reduzierte die Wasserkontaktwinkel auf der SM-Titanoberfläche auf 70° (hydrophiler Status; Abb. 8A; P < 0,05, Tukeys HSD-Test) und hielt die Winkel auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen unter 10° (superhydrophil) (P > 0,05). , Tukeys HSD-Test). Die FTIR-Analyse zeigte, dass UV-Bestrahlung den Status der Hydroxylgruppen auf den SM- und NR2-Titanoxidoberflächen nicht beeinflusste, jedoch die Hydroxylgruppen auf den NR1-Titanoxidoberflächen löschte (Abb. 8B).

Beteiligung der Nanotopographie an der Makrophagenaktivierung durch Titandioxid-Nanooberflächen (A) Wasserkontaktwinkel, bestimmt mit der Methode des sessilen Tropfens. (B) Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) von Titanblechen mit glatten (SM) und nanoaufgerauten (NR) 1- und 2-Oberflächen vor (wie vorbereitet) und nach der UV-Bestrahlungsbehandlung. Die schwarzen Pfeile in den FTIR-Spektren zeigen Spektralpeaks an, die Hydroxylgruppen (–OH) entsprechen. (C) Genexpressionen von Toll-like-Rezeptor (TLR) 4, TLR2, Makrophagenrezeptor mit kollagener Struktur (MARCO) und Klasse-A-Makrophagen-Scavenger-Rezeptoren (SR-A) im Verhältnis zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), wie analysiert durch Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in J774A.1-Zellen, die 3 Tage lang auf SM-, NR1- und NR2-Oberflächen kultiviert wurden, die vorbestrahlt und nicht mit UV-Strahlung bestrahlt wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD; N = 3). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin (P < 0,05; Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest [HSD] in A und Bonferronis Mehrfachvergleichstest in C).

Im vorbereiteten Zustand erhöhten beide Titandioxid-Nanooberflächen die Expressionsniveaus von TLR4, TLR2 MARCO und SR-A in unbehandelten J774A.1-Zellen am Tag 3 konsistent (Abb. 8C; P < 0,05, Mehrfachvergleichstest von Bonferroni). Die UV-Vorbestrahlung auf den Titan- und Titanoxidoberflächen regulierte die Expression dieser Gene in Makrophagen hoch (P < 0,05, Bonferronis Mehrfachvergleichstest), mit Ausnahme der NR1-Titanoxidoberflächen, die die Expression dieser Gene nach der UV-Vorbestrahlung immer reduzierten ( Abb. 8C; P < 0,05, Bonferroni-Mehrfachvergleichstest). Insbesondere die TLR4-Expression auf NR2-Titandioxid-Oberflächen war nach UV-Vorbestrahlung deutlich hochreguliert. UV-bestrahlte SM-Titanoberflächen regulierten die Expression dieser Markergene in Makrophagen auf ein Niveau, das denen auf beiden Arten von so präparierten Titandioxid-Nanooberflächen nahekommt (P < 0,05, Bonferronis Mehrfachvergleichstest).

Sowohl die NR1- als auch die NR2-Titanoxidoberfläche regulierten die Expression von M1-Markern (iNOS und TNF-α), nicht jedoch von M2-Markern (Arg1) (Abb. 2A, B und 6B), in der Maus-Makrophagen-Zelllinie J774A.1 deutlich auf ein bestimmtes Niveau nahe denen in M1-induzierten Zellen. In diesen Zellen wurden eine kreisförmige Zellform und eine starke iNOS-Expression beobachtet (Abb. 2C). Bei Zellen, die auf den NR1- und NR2-Oberflächen gezüchtet wurden, wurde keine Zytotoxizität beobachtet (Abb. 2D). Die TNF-α-Expression in J774A.1-Zellen auf Polystyrolplatten und auf den SM- oder MR-Titanoberflächen wurde durch LPS-Zugabe ebenfalls hochreguliert, aber die Werte waren auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen geringer als die in Makrophagen, selbst ohne LPS-Zugabe (Abb. 6B). ). Diese Beobachtungen stimmten mit den Ergebnissen unserer vorherigen Studie überein, die zeigte, dass dieselben Titandioxid-Nanooberflächen eine von der Maus stammende Makrophagenzelllinie in einen M1-ähnlichen Typ polarisierten, der durch eine kreisförmige Zellform mit filopodiumähnlichen Vorsprüngen und die Produktion von Hemmfaktoren für die Osteoklastogenese gekennzeichnet ist27. Diese M1-Marker regulieren nicht nur das Immunsystem, sondern aktivieren auch die Makrophagen-Phagozytose. TNF-α könnte die phagozytische oder chemotaktische Aktivität von Makrophagen durch autokrine Signale aktivieren31. Von Makrophagen verschlungene Mikroben werden intrazellulär durch reaktive Sauerstoffspezies über die iNOS-Reaktion abgetötet32. Beide Titandioxid-Nanooberflächen stimulierten die phagozytische Aktivität von Makrophagen im Vergleich zu den SM- und MR-Titanoberflächen deutlich (Abb. 4A). Die Expression von Phagozytose-bezogenen Rezeptoren wie TLR2, TLR4 (Abb. 3A-C, 6C, 7C), MARCO und SR-A (Abb. 4B und Abb. 7C) in Makrophagen war sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene erhöht wenn es auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen ohne Ligandenstimulation kultiviert wird. Die auf allen Oberflächentypen nachgewiesenen Endotoxinkonzentrationen waren extrem niedrig und lagen unter dem Grenzwert für die Ausübung biologischer Wirkungen in Zellkulturexperimenten (0,03 EU/ml)33 (Abb. 2E). Beide Nanooberflächen regulierten die TLR4- und TLR2-Expression in unbehandelten Zellen sogar in serumfreiem Medium (Abb. 3D), wo die Möglichkeit der Ablagerung unbekannter Liganden auf den Oberflächen mit Nanotopographie34 nicht hätte auftreten dürfen. Phagozytose-bezogene Rezeptoren induzieren die Bildung von Phagozytosebechern durch Aktin-Remodellierung und Membranvorwölbungsverlängerung. Phagosome werden gebildet, nachdem der Phagozytosebecher versiegelt wurde, und reifen nach und nach durch eine Reihe von Fusions- und Spaltungsereignissen von einem frühen Phagosom zum späten Phagosom heran35. Es ist bekannt, dass TLR2 und TLR4 an der Phagozytose muriner Makrophagen beteiligt sind. Bei der frühen Phagosomenbildung werden TLR2 und TLR4 in den Phagozytenbecher rekrutiert, um Signalwege zu aktivieren, die durch Toll/Interleukin-1-Rezeptor-Homologie (TIR)-Domänen enthaltende Adapterproteine ​​für die Phagosomenreifung vermittelt werden36,37,38,39. Daher aktivierten beide Titandioxid-Nanooberflächen die phagozytische Aktivität von Makrophagen durch M1-ähnliche Polarisation direkt mit Oberflächeneigenschaften.

Die Expression der Phagozytose-bezogenen Gene, mit Ausnahme von MARCO, wurde in den meisten Fällen durch Ligandenstimulation nicht hochreguliert, einschließlich M1- oder M2-induzierender Reagenzien (Abb. 3A, B, D und Abb. S1), TLR2-Ligand-Zymosan ( Abb. S2) und TLR4-Ligand LPS (Abb. 6C), während die MARCO-Expression durch M1-Induktion erfolgte (Abb. S1). Mikrokügelchen regulierten die MARCO- und SR-A-Expression unabhängig vom Substrattyp nicht hoch (Abb. 4B). Darüber hinaus wurde die Hochregulierung der iNOS-, TNF-α-, TLR2- und TLR4-Expression in J774A.1-Zellen auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen durch Vorinkubation mit Anti-TLR2-Antikörpern nicht blockiert (Abb. 5). Diese Beobachtungen zeigten, dass die Hochregulierung der Phagozytose-bedingten Genexpression in Makrophagen auf Titandioxid-Nanooberflächen unabhängig von der Ligandenstimulation war und nicht auf die Erkennung der Titandioxid-Oberfläche selbst als Fremdkörper zurückzuführen war. Daher aktivierten Titandioxid-Nanooberflächen die Makrophagen-Phagozytose als Ergebnis der Rückkopplung nach nicht-entzündlicher Stimulation mit Oberflächeneigenschaften.

Fokale Adhäsionsplaques sind entscheidend für die Wahrnehmung der physikalischen Hinweise der Oberflächentopographie, selbst für Makrophagen40. Fokale Adhäsions-bezogene Signalwege können entzündungsfördernde Reaktionen in Makrophagen regulieren, indem sie mit einem Adapterprotein interagieren, das TLR2- oder TLR4-Signale weiterleitet41,42,43. In Makrophagen regulieren die fokalen Adhäsionsmoleküle, Integrine, die TLR2-vermittelte Erkennung mikrobieller Komponenten44. Ein bestimmter Integrintyp reguliert die TLR4-vermittelte proinflammatorische Reaktion in Makrophagen, indem er die Expression von CD1445 reguliert, das die TLR4-vermittelte Endozytose auslöst46. Die Expression des fokalen Adhäsionsadapterproteins Paxillin in J774A.1-Zellen nahm am ersten Tag auf beiden Titandioxid-Nanooberflächen zu, insbesondere auf den NR2-Titandioxid-Oberflächen auf Gen- und Proteinebene (Abb. 7A-C). Titanoxid-Nanooberflächen können die Zellanhaftung47 verbessern, indem sie fokale Adhäsionsplaques an den Spitzen der Oberfläche anordnen48. In dieser Studie wiesen beide Arten von Titandioxid-Nanooberflächen eine deutlich höhere Spitzendichte auf als die MR-Oberflächen; NR2-Titanoxidoberflächen hatten eine 1,3- bzw. 4-mal höhere Spitzendichte als die NR1- bzw. MR-Oberflächen (Abb. 1A). Abgesehen von der Unregelmäßigkeit im Mikrometerbereich der MR-Titanoberflächen wiesen die NR2-Titandioxidoberflächen die höchsten vertikalen Rauheitswerte im Submikronbereich auf, die doppelt so hoch oder höher waren als die der NR1- oder SM-Titanoberflächen (Abb. 1B). Die Paxillin-Expression zeigte eine positive lineare Beziehung zur Spike-Dichte (Abb. 7E) sowie zu den TLR4- und TLR2-Expressionsniveaus (Abb. 7F) für die in dieser Studie verwendeten aufgerauten Oberflächen. Das Flächenverhältnis der leuchtenden Flecken pro Flächeneinheit zeigte auch eine positive lineare Beziehung zur Spitzendichte (Abb. 7E) und zu den TLR4- und TLR2-Expressionsniveaus (Abb. 7F). Darüber hinaus ragten die Nanospikes auf den NR-Titandioxid-Oberflächen aus dem Zellkörper von Makrophagen hervor, wie die leuchtenden Flecken auf der Zelloberfläche zeigen, die mit den Eckpunkten im REM übereinstimmen (Abb. 7D und E). 2D-NR-Titanoxidoberflächen, wie z. B. Nanoröhrenarrays aus Titanoxid49,50, Nanokanäle aus Titan-Zirkonoxid-Legierungen51 und reine Titanbeschichtungen52, regulierten Makrophagen oder Zelllinien, um die Produktion entzündungsfördernder Zytokine und Chemokine zu reduzieren. Die Spitzen dieser Nanooberflächen hatten relativ runde Enden, im Gegensatz zu den spitzen Spitzen auf den in dieser Studie verwendeten NR-Titanoxidoberflächen oder den vertikalen 1D-Nanostrukturen für die Aktivierung von Lymphozyten20,21,22. Die Kontaktstimulation durch Nanospikes auf den Titandioxid-Nanooberflächen könnte die Expression von phagozytosebezogenen Rezeptoren und schließlich die phagozytische Aktivität von Makrophagen durch direkte physikalische Reize induziert oder die Bildung fokaler Adhäsionsplaques oder beides gefördert haben (Abb. 9).

Aktivierung der Makrophagen-Phagozytose durch Kontaktstimulation durch Nanospikes auf Titandioxid-Nanooberflächen. Schema, das einen möglichen Mechanismus zeigt, der der Aktivierung der Makrophagen-Phagozytose durch Titandioxid-Nanooberflächen zugrunde liegt. Titania-Nanooberflächen polarisieren Makrophagen über topografische Hinweise 27 in einen M1-ähnlichen Typ, um die Produktion von entzündungsfördernden Mediatoren wie iNOS und TNF-α zu fördern. Unterdessen fördern die Nanospikes auf Titandioxid-Nanooberflächen die Bildung fokaler Adhäsionsplaques und geben dem Makrophagen-Zellkörper physikalische Reize. Diese Kontaktstimulationen durch Titandioxid-Nanospikes könnten die Expression von Phagozytose-bezogenen Rezeptoren wie TLR2, TLR4, MARCO und SR-A auslösen und schließlich die Phagozytose und die nachfolgenden Prozesse aktivieren. Entzündungsfördernde Mediatoren können bei der Makrophagen-Chemotaxis oder der intrazellulären Verdauung von Fremdkörpern hilfreich sein. iNOS, induzierbare Stickoxidsynthase; TNF-α, Tumornekrosefaktor-alpha; TLR, Toll-like-Rezeptor; MARCO, Makrophagenrezeptor mit kollagener Struktur; SR-A, Makrophagen-Scavenger-Rezeptor der Klasse A.

Beide Titandioxid-Nanooberflächen waren mit der Hydroxylgruppe superhydrophil, im Gegensatz zur SM-Oberfläche, die ohne die funktionelle Gruppe hydrophob war (Abb. 1C und D). Nach der durch UV-Bestrahlung vermittelten Hydrophilisierung behielten die Titanoxidoberflächen NR1 und NR2 ihre Superhydrophilie bei, NR1 verlor jedoch die Hydroxylgruppe, im Gegensatz zu NR2, das die funktionelle Gruppe behielt (Abb. 8A und B). Die SM-Titanoberfläche wurde nach der UV-Behandlung auch ohne Hydroxylgruppen hydrophil (Abb. 8A und B). Durch die UV-Behandlung wurde die Expression von TLR2 und TLR4 auf den NR2-Titandioxid-Oberflächen weiter hochreguliert, wohingegen sie die phagozytosebedingte Genexpression auf den NR1-Titandioxid-Oberflächen herunterregulierte (Abb. 8C). Die Expression dieser Gene wurde sogar auf der UV-bestrahlten SM-Oberfläche hochreguliert, wenn auch nicht so stark wie auf den so präparierten Titandioxid-Nanooberflächen (Abb. 8C). Die Hydrophilie und die Hydroxylgruppen erleichtern möglicherweise die Zellanhaftung53,54. Die durch UV-Bestrahlung vermittelte Hydrophilisierung veränderte jedoch nicht die Expression von M1-Genmarkern in Makrophagen auf den Titandioxid-Nanooberflächen27. Diese Beobachtungen legen nahe, dass UV-Bestrahlung sekundäre Veränderungen der Oberflächeneigenschaften hervorgerufen haben könnte, die die phagozytische Genexpression von Makrophagen beeinflussen.

Aufgrund des photokatalytischen Effekts55 erzeugt UV-Bestrahlung Sauerstofffehlstellen auf Titan- oder Titanoxidoberflächen, indem die sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffmoleküle, die sich auf natürliche Weise auf diesen Oberflächen ablagern, zersetzt werden56. Sauerstofffehlstellen bilden im Allgemeinen durch Adsorption von Wassermolekülen aus der Atmosphäre Hydroxylgruppen auf Titan- oder Titanoxidoberflächen, was zu einer stark hydrophilen Oberfläche führt57. Die in dieser Studie verwendete UV-Behandlung behielt jedoch die Hydrophilie der SM- oder NR1-Oberflächen bei, ohne dass Hydroxylgruppen vorhanden waren (Abb. 8A und B). Der UV-vermittelte photokatalytische Effekt induzierte eine positive Ladung auf den Titan- oder Titanoxidoberflächen, indem er über den Übergang von Elektronen vom Valenzband zum Leitungsband Elektron-Loch-Paare erzeugte58. Elektrisch polarisierte Materialoberflächen üben Hydrophilie aus59. In dieser Studie wurden unmittelbar nach der Behandlung Oberflächenanalysen bzw. Kulturexperimente auf UV-bestrahlten Oberflächen durchgeführt. UV-vermittelte elektrische Anregung könnte die Hydrophilie von Titan- oder Titanoxidoberflächen erhöht oder aufrechterhalten haben60.

Darüber hinaus fördern durch UV-Bestrahlung elektrisch angeregte Titan- oder Titanoxidmaterialien die Zelladhäsion an den Oberflächen61. Allerdings nimmt die Zelladhäsion ab, wenn die UV-Bestrahlungsenergie überschritten wird62. Stachelige Spitzen von Titan- oder Titanoxidoberflächen ermöglichen die Konzentration der inhärenten Oberflächenladung auf den Spitzen63, um nicht nur Adhäsionsproteine ​​zu adsorbieren, sondern auch verschiedene Arten von Zellkörpern physikalisch zu stimulieren5,24. Die elektrische Stimulation führt zu einer Aktinpolarisierung und Clusterbildung von Phagozytenrezeptoren, um die Phagozytenaktivität in Makrophagen zu stimulieren64. Synergistische Effekte von Titandioxid-Nanospikes und physikalischen Oberflächeneigenschaften, insbesondere elektrischen Potentialen, auf das Verhalten von Makrophagen könnten für zukünftige Forschung von großem Interesse sein.

Diese Studie zeigte eine neuartige Erkenntnis, dass Titandioxid-Nanooberflächen mit Nanospikes die phagozytische Aktivität von Makrophagen unabhängig von der Ligandenstimulation aktivieren. Diese durch Titandioxid-Nanooberflächen vermittelte Makrophagenaktivierung könnte durch Ligandenstimulation verstärkt werden, wie durch eine weitere Hochregulierung der TNF-α- und GM-CSF-Expression in Zellen auf Titandioxid-Nanooberflächen bei gleichzeitiger Inkubation mit LPS gezeigt wird (Abb. 6B). Titanoxid-Nanooberflächen können als zweidimensional gemusterte Plattform zur Schaffung einer künstlichen Kulturumgebung eingesetzt werden, die eine durch übermäßige Makrophagen-Phagozytose verursachte Immunerkrankung wie die Alzheimer-Krankheit nachahmt65. Darüber hinaus hemmen Makrophagen auf Titandioxid-Nanooberflächen die Differenzierung von Präosteoklasten durch die Produktion eines Hemmfaktors für die Osteoklastogenese27 wie GM-CSF66. Titania-Nanooberflächenimplantate können eine entzündliche Osteolyse durch Aktivierung der Phagozytose und eine erhöhte Produktion eines Hemmfaktors für die Osteoklastogenese in Makrophagen verhindern, selbst nach einer Infektion. Der Einfluss der Makrophagenzellform auf die Polarisation kann jedoch je nach Zelltyp unterschiedlich sein. Wie in primären aus dem Knochenmark stammenden16, peritonealen Makrophagen67 und der J774A.1-Zelllinie27 gezeigt, neigen aus der Maus stammende Makrophagen dazu, zum M1- oder M2-Typ polarisiert zu sein, wenn sie kreisförmig bzw. spindelförmig sind. Im Gegensatz dazu ist der Zusammenhang zwischen Zellform und Art der Polarisation bei Makrophagen menschlichen Ursprungs unterschiedlich. Inkonsistente Zellformen wie Spiegelei-ähnliche68 oder längliche Spindelformen69 wurden in M1-polarisierten Makrophagen beobachtet, die sich in vitro von menschlichen peripheren Blutmonozyten differenzierten. Die humane monozytäre Leukämiezelllinie neigt dazu, bei M1-Induktion eine spindelartige Zellform aufzuweisen70. Daher ist es notwendig, die Auswirkungen von Titandioxid-Nanooberflächen auf vom Menschen stammende Makrophagen in Zukunft zu überprüfen71. Dieser neuartige Ansatz zur Abstimmung der Funktionen von Immunzellen durch Kontaktstimulation durch zweidimensional strukturierte Plattformen würde jedoch wichtige Informationen für die Weiterentwicklung therapeutischer Biomaterialien oder diagnostischer Instrumente für immunologische Interventionen liefern.

Die durch Alkaliätzbehandlung erzeugten 2D-Titanoxid-Nanooberflächen aktivieren die Makrophagen-Phagozytose durch die Hochregulierung von Phagozytose-bezogenen Rezeptoren durch Nanospike-vermittelte ligandenunabhängige Kontaktstimulation, unterstützt durch physikalische Oberflächeneigenschaften.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Rohdaten und verarbeiteten Datensätze sind im Mendeley Data Repository verfügbar, https://doi.org/10.17632/bvpvk39svk.1.

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Wir danken der Instrumental Analysis Group Graduate School of Engineering Tohoku University für technische Unterstützung bei der FTIR-Analyse. Diese Arbeit wurde durch Grant-in-Aids for Scientific Research (B: 17H04387, MY und HE; B: 20H03874, MY und HE) und Grant-in-Aids for Challenging Exploratory Research (17K19742, MY und HE) aus Japan unterstützt Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft und Stiftung Nakao for Worldwide Oral Health (2021–2022: HE).

Abteilung für molekulare und regenerative Prothetik, Tohoku University Graduate School of Dentistry, 4-1 Seiryo-machi, Aoba-ku, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japan

Nadia Kartikasari, Masahiro Yamada, Jun Watanabe, Watcharaphol Tiskratok, Xindie He und Hiroshi Egusa

Zentrum für fortgeschrittene Stammzell- und regenerative Forschung, Tohoku University Graduate School of Dentistry, Sendai, Miyagi, Japan

Hiroshi Egusa

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NK, Untersuchung, Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. MY, Konzeptualisierung, Untersuchung, Methodik, formale Analyse, Finanzierungsbeschaffung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Zeugen Jehovas, Untersuchung, Methodik, formale Analyse, Schreiben – Rezension. WT, Untersuchung, Methodik, Schreiben – Rezension. XH, Methodik, Schreiben – Rezension. HE, Konzeptualisierung, Supervision, formale Analyse, Finanzierungseinwerbung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Masahiro Yamada oder Hiroshi Egusa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kartikasari, N., Yamada, M., Watanabe, J. et al. Titania-Nanospikes aktivieren die Makrophagen-Phagozytose durch ligandenunabhängige Kontaktstimulation. Sci Rep 12, 12250 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16214-2

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Eingegangen: 23. März 2022

Angenommen: 06. Juli 2022

Veröffentlicht: 18. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16214-2

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